PCR, полимераз чылбыр реакциясе, ул DNTP, Mg2 +, озынлык факторларын һәм көчәйтү көчәйтү факторларын ДНК полимеразы катализы астында системага кушуны аңлата, төп ДНКны шаблон һәм махсус праймериз итеп куллана, Денатурация, аннальинг, киңәйтү һ.б. адымнары аша, витрода кызның ДНКны кабатлау процессы ата-ананың шаблоны ДНКны тулыландыра, витродагы теләсә нинди максатлы ДНКны тиз һәм махсус көчәйтә ала.
1. Кайнар старт PCR
Гадәттәге PCR көчәйтүнең башлану вакыты PCR машинасын PCR машинасына кую түгел, аннары программа көчәйтә башлый.Система конфигурациясе тәмамлангач, көчәйтү башлана, бу конкрет булмаган көчәйтүгә китерергә мөмкин, һәм кайнар старт PCR бу проблеманы чишә ала.
PCR кайнар старт нәрсә ул?Реакция системасы әзерләнгәннән соң, фермент модификаторы югары температурада (гадәттә 90 ° C-тан югары) реакциянең башлангыч җылыту этабында яки "кайнар старт" этабында чыгарыла, шулай итеп ДНК полимерасы активлаша.Төгәл активлаштыру вакыты һәм температурасы ДНК полимеразының табигатенә һәм кайнар старт модификаторына бәйле.Бу ысул, нигездә, ДНК полимераз эшчәнлеген тыю өчен антителалар, аффинит лигандлар яки химик модификаторлар кебек модификаторларны куллана.ДНК полимеразының активлыгы бүлмә температурасында тыелганлыктан, кайнар старт технологиясе PCR реакцияләренең үзенчәлеген корбан итмичә, бүлмә температурасында берничә PCR реакция системасын әзерләү өчен зур уңайлыклар тудыра.
2. RT-PCR
RT-PCR (Кире транскрипция PCR) - mRNAдан cDNAга кире транскрипция һәм аны көчәйтү шаблоны итеп куллану өчен эксперименталь техника.Эксперименталь процедура - тукымаларда яки күзәнәкләрдә гомуми РНКны чыгару, Олиго (dT) праймер итеп куллану, CDNA синтезлау өчен кире транскриптаз куллану, аннары максатлы ген алу яки ген экспрессиясен табу өчен cDNAны PCR көчәйтү шаблоны итеп куллану.
3. Флюоресцент санлы PCR
Флуоресцент санлы PCR (Реаль вакыт санлы PCR,RT-qPCR) PCR реакция системасына флуоресцент төркемнәрне өстәү, бөтен PCR процессын реаль вакытта күзәтү өчен флюоресцент сигналлар туплау ысулын һәм шаблонны санлы анализлау өчен стандарт сызыкны куллана.Гадәттә кулланыла торган qPCR ысулларына SYBR Green I һәм TaqMan керә.
4. Ояланган PCR
Ояланган PCR ике этап PCR көчәйтү өчен PCR праймерларын куллануны аңлата, һәм икенче турның көчәйтү продукты - максатлы ген фрагменты.
Беренче пар праймерларның туры килмәве (тышкы праймериз) специфик булмаган продуктның көчәйтелүенә китерсә, шул ук специаль булмаган төбәкнең икенче пар праймериз тарафыннан танылуы һәм көчәйтелүен дәвам итү мөмкинлеге бик аз, шуңа күрә икенче пар праймер белән көчәйтү, PCR үзенчәлеге яхшырды.Ике тур PCR башкаруның бер өстенлеге - ул чикләнгән башлангыч ДНКдан җитәрлек продуктны көчәйтергә ярдәм итә.
5. PCR кагылу
Touchdown PCR - PCR цикл параметрларын көйләп PCR реакциясенең үзенчәлеген яхшырту ысулы.
PCR кагылганда, беренче берничә цикл өчен аннальинг температурасы праймерларның максималь аннальинг температурасыннан берничә градуска кадәр куелган.Higherгары анналь температура специфик булмаган көчәйтүне эффектив рәвештә киметергә мөмкин, ләкин шул ук вакытта, югары анналь температура праймерларның һәм максат эзлеклелегенең аерылуын көчәйтәчәк, нәтиҗәдә PCR җитештерүчәнлеге кими.Шуңа күрә, беренче берничә циклда, аннальинг температурасы гадәттә системада максатлы генның эчтәлеген арттыру өчен циклга 1 ° C ка кадәр кимергә тиеш.Анналь температура оптималь температурага төшерелгәндә, калган цикллар өчен аннальинг температурасы саклана.
6. Туры PCR
Туры PCR максатлы ДНКны көчәйтүне аңлата, нуклеин кислотасын изоляцияләү һәм чистарту кирәксез.
Туры PCRның ике төре бар:
туры ысул: аз күләмдә үрнәк алыгыз һәм PCR идентификациясе өчен турыдан-туры PCR Master Mix-ка өстәгез;
яраклаштыру ысулы: үрнәкне алганнан соң, аны лизатка кушыгыз, геномны чыгару өчен лизаны, аз күләмле лизланган супернатантны алыгыз һәм PCR Master Mix-ка кушыгыз, PCR идентификациясен эшләгез.Бу ысул эксперименталь эш процессын гадиләштерә, вакытны киметә, чистарту адымнары вакытында ДНК югалтудан саклый.
7. SOE PCR
Ген бүленеше PCR (SOE PCR) өстәмә продуктлар ярдәмендә өстәмә продуктлар куллана, PCR продуктларын кабат чылбыр формалаштыра, шулай итеп киләсе көчәйтү реакциясендә, кабатланган чылбырларны киңәйтеп, көчәйтелгән фрагментлар капланган техниканың төрле чыганаклары. һәм бергә бүленде.Бу технологиянең хәзерге вакытта ике төп куллану юнәлеше бар: кушылу геннары төзелеше;ген сайтына юнәлтелгән мутация.
8. IPCR
Кире PCR (IPCR) ике праймердан башка ДНК фрагментларын көчәйтү өчен кире тулыландыргыч праймериз куллана, һәм билгеле ДНК фрагментының ике ягында билгесез эзлеклелекне көчәйтә.
IPCR башта билгесез төбәкләрнең эзлеклелеген билгеләү өчен эшләнгән, һәм күбесенчә ген промоутер эзлеклелеген өйрәнү өчен кулланыла;он кушылучан хромосомаль үзгәртеп корулар, мәсәлән, ген кушылуы, транслокация һәм транспозиция;һәм вируслы ген интеграциясе, гадәттә хәзер дә кулланыла. Сайтка юнәлтелгән мутагенез өчен, кирәкле мутация белән плазмидны күчерегез.
9. dPCR
Санлы PCR (dPCR) - нуклеин кислотасы молекулаларын абсолют санлаштыру ысулы.
Нуклеин кислотасы молекулаларын санлаштыру өчен хәзерге вакытта өч ысул бар.Фотометрия нуклеин кислотасы молекулаларының үзләштерүенә нигезләнә;реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR (Real Time PCR) Ct кыйммәтенә нигезләнә, һәм Ct кыйммәте ачыклана торган флуоресцент кыйммәтенә туры килгән цикл номерын аңлата;санлы PCR - нуклеин кислотасын санау өчен бер молекулалы PCR ысулына нигезләнгән соңгы санлы технология - абсолют сан ысулы.
Пост вакыты: 13-2023 июнь